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                什麽是代謝組學

                1. 什麽是非靶向代謝組學和靶向代謝組學?

                非靶向代謝組學(Untargeted metabolomics):即非目標代謝組⊙學或發現代謝組學,無偏向性地對所有小分子代謝物同時進行檢測分析的代謝組學。

                靶向代謝組學(Targeted metabolomics):即目標性代謝組學或定量代謝組學,僅對感興趣的目標性代謝物進行同時定量分』析的代謝組學。

                2. 代謝組學可以研究哪些樣本?

                代謝組學可以研究各類生物樣本

                按物種分:人、動物、植物、微生物等

                按樣本類型分:細胞、組織、生物體液,其中生物體液主要有血清/血漿、尿液、腦脊髓液、膽汁、精液、唾液等。

                3. 代★謝組學有哪些應用?

                近年來,代謝組學技術得到了迅速發展,主要可應用於 功能基因組學疾病早期診斷病因病機研究藥物毒理〓學中醫藥現代化植物代謝組學微生物代謝組學營養學環境科學等領域。

                實驗設計與樣本處理

                1. 代謝組學生物學重復如何設計?

                一般來說,植物、細胞、微生物等最少6個生物學重復;
                動物樣本,由於其個體化差異較大,包括組織、血、尿液〇等至少10個生物學重復;
                臨床樣本,個體差異更大,血漿、尿液等要在30個生物學重復左右,無上限。具體根據文章發表檔次和設計定。

                2. 樣本收集●和處理應遵循哪些原則?

                代謝組學樣本的采集及處理規範標準化至關重要,稍不註意極可能導致結果“失之毫厘,謬以千裏”,在樣本采集和處理時需遵循以下原則:

                快速原則

                在采集、處理及快遞過程@中,需全程保持低溫

                低溫原則

                在采集、處理及快遞過程中,需全程保持低溫

                代表性原則

                取樣必須具有代表性,尤其是ξ 糞便、組織等樣本

                一致性原則

                各個樣本的采集、處理均應保持高度一致,如采樣♀部位、離心速率、試劑和耗材品牌等

                避免汙染

                最好采用無◆菌器材,保持實驗室清潔,避免雜質混入樣本等

                為了保證結果的準確性,我公司制︼定了各類樣本嚴格的采集、處理操作規程,客戶可聯系我們獲取相關資料。

                3. 樣本采集、處理時需要註意哪些事項?

                樣本采集:

                血漿樣本建議使用EDTA或肝素鈉作為抗凝劑;動物尿液,如24 h大鼠尿液采集時需加入疊氮化鈉;組織樣本建議活體采集,若是動物樣本建議麻醉後采集,麻醉劑建議使用異氟醚;細胞樣本要避免細胞破裂。

                樣本處理:

                使用液氮快速冷凍處理▃樣本;血液樣本采集時一定要避免溶血;避免樣本反復凍融;使用幹冰冷藏運輸。

                4.需要準備多╱少量的樣本?

                代謝組學對各類型樣本的需求量有所差異,我們一般要∞求:

                血漿、血清、尿液:大於250 μL/例

                發酵液:大於50 mL/例

                腸道內容物、動物組織及器官:大於250 mg/例

                昆蟲、植物組織:大於250 mg/例

                微生物幹重:大於250 mg/例

                細胞樣本:需1x107個/mL

                其他類型的樣本送樣量可以聯系我們進行確認。

                5.樣本如何儲存、運輸?

                各類㊣生物樣本應儲存於-80℃冰箱或液氮罐中;運輸『的過程中請使用並保證足夠的幹冰(一般以3公斤幹冰/天揮發算)。

                非靶向代謝組學檢測平臺

                1. 代謝組學檢測平臺有哪些,如何去選擇?

                主要檢測平臺有GC-MS、LC-MS和NMR。所有的樣品類型都可以用這3種平臺檢測。

                ● 一般來講植物類型的樣品優選GC-MS(初級代謝產物),然後考慮做LC-MS(次級代謝產物)

                ● 血漿優選LC-MS

                ● 尿液優先LC-MS和NMR

                ● 組織樣本優選LC-MS

                ● 微生物優選GC-MS和LC-MS

                具體選擇哪種∩平臺需要根據項目具體分析。

                2. 代謝組學平臺各自優缺點是什麽?

                NMR、GC-MS和LC-MS比較

                序號 分析平臺 優點 缺點
                1 NMR 高通量;普適性;良好的客觀性和重現性;快速(2~3 min/樣);預處理簡單,不※需要→衍生化和分離;無損傷性;能檢測樣品中大多數有機類化合物;儀器使用壽命長 檢測動態範圍窄;靈敏度和分辨率較MS低;樣品用↑量相對大(0.1~0.5 mL);儀器成本高
                2 GC-MS 高通量;高精密度、靈敏度及重現性;具有可參考的標準譜圖數據庫,易於定性;樣品用量適中(0.1~0.2 mL);可檢測樣品中大多數有機和部分無機分子 需要衍生化;需要分離;分析速度較慢(20~40 min/樣);較難鑒定新化合物;不適用於難揮發性、熱不穩定性物質的分析
                3 LC-MS 高通量;高分別率、靈敏度;檢測動態範圍寬;樣品處理簡單,不需要衍生化;樣品用量少(10~100 μL);適用於熱不穩定性、不易揮發、不易衍生化和分子量較大的物質 分析速度較慢(15~40 min/樣);缺少可以參考的標準譜圖數據庫;較難鑒定新化合物;成本較高;儀器壽命較短

                3. 哪些類型的機器(LC-MS)可以做非靶向代謝組學?

                目前可以做非靶向代謝組學的機器主要為高分辨率的液」質聯用設備,設備主要為Q-TOF,Orbitrap這兩種類型的機器,一般都能做到5ppm內的分辨率,滿足非靶向代謝組學的需求。我公司目前擁有高分辨率質譜Thermo LTQ Orbitrap XL系統。

                4. LC-MS可以檢測哪些類型的物質?

                我公司用到的離子源主要是ESI源的,比較適合於檢測中等極性化合物和高極性化合物的物質,從具體的物質類型來講,有 脂肪酸醇類酚類維生素類有機酸多胺核苷酸多酚萜烯黃酮脂類 等化合物。

                5. GC-MS測水溶性的物質主要能測哪些類型的物質?

                主要可檢測氨基酸、有機酸、脂肪酸、糖、多元醇、胺類、糖磷酸等物質,主要涉及氨基酸代謝、糖代謝、TCA循環等代謝通路。這裏值得註意的是,GC-MS測水溶性的物質需要衍生化,因為只有當樣品能☉揮發且遇熱穩定時才能直接進行GC-MS分析。

                6. 你們公司◆的GC-MS用的是什麽機器,什麽柱子,符合發表代謝組文章的要求麽?

                我公司擁有Agilent 7890A氣相色譜儀5975C質譜儀∴系統,色譜柱為HP5 MS(30 m × 25 mm)。此系統已經廣泛應用到食品、農業、醫學等各個領域,相關文章已經發表至 PNASanalytical chemistryMetabolomicsJournal of Chromatography BJournal of Chromatography A 等高水平的雜誌。

                代謝組學數據分析

                1. 非靶向代謝組卐學如何做質控?

                質控的目的是考察系統的穩定性,我們會將所有樣本混合作為質控(QC)樣本。一般每隔10個樣本進一針質控樣本,結果以QC樣本誤差2SD以內,PCA圖上不分離為標準。我公司QC樣∑ 本的分析不單獨收取任何費用

                2.代謝組學分析常用數據庫有哪些?

                主要定性數據庫有:

                NISTGMDHMDBMetlinMassBank

                主要代謝通路分析數據庫有:

                Pathway viewers KEGG代謝組學在線數據分析系統MetaboAnalyst

                3.GC-MS分析的時候有一些同分異▼構體,如何解決?

                我們公司在用GC-MS代謝組的過程中,考慮到了這些問題:

                (1) 首先我們會通過↘NIST,GMD,weily及本公司已有的一些數據庫進行搜庫鑒定,尋找最相似的一些物質;

                (2) 然後我們會結合待檢物質的保留指數(Retention indices)進行物質精確定性,以上兩步保證ω 了物質的精確定性,包括同分異構體;

                (3) 同時如果待檢物】質在我公司具有標準品(我公司超過百種標準品),會最終定性該物質。

                4.LC-MS代謝物定性一般步驟是什麽?

                首先采用ぷ高分辨率質譜Q-TOF或Orbitrap通過一級質譜分子量全譜掃描,獲得的結果實質上為物質的分子量,由於依舊有10ppm內的誤差及一個分子量可能有多個物質對應,需要進行二級質譜打碎物質【,獲得物質碎片,最終√通過搜庫和標準品來最終確認。

                5.你們能提供哪些數據分析內容?

                我們能提供完善的代謝組學數據分析內容,主要包括:

                (1) 數據預處理——數據質量◤控制、TIC/BPC圖、總體代謝物層次聚類分析和總體樣本樹狀分析等;

                (2) 多元統計分析——PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析;

                (3) 差異代謝物的篩▆選與註釋;

                (4) 統計分析——箱式圖/柱狀圖、Z-score圖、差異代謝物層次聚類分析、關聯熱圖分析、ROC曲線分析等;

                (5) 高級數據分析——代謝通路分析、差異代謝物關聯網絡分析等;

                具體的分析ㄨ內容需根據項目內容及樣本類型而定

                靶向代謝組學

                1. 你們靶向代謝組學平臺有哪些?

                我們靶向□ 代謝組學分析平臺主要有液相色譜系統、Aglient 7890A/5975C氣-質聯用儀系統和AB Sciex API 4000? LC/MS/MS系統。

                2. 靶向代謝組學為什麽還需要做方法驗證?

                代謝物定量是一個嚴謹的過程,液相、氣相及質譜本身穩定性的特點,除了需要進行制作標準曲線以外,任需要進行的驗證內容●有: 準確度精密度(包括重復性、中間精密度和∑ 重現性)專屬性檢測限定量限等, 應視具體方法擬訂驗證的內容,這樣才能保證定量¤是準確可靠的。

                3.靶向代謝組學為什麽一定要提供標準品?

                靶向代謝組學是針對目標代謝物進行定性定量分析的一門研究,其中定量的過程中,需要首先建立目標代謝物的標準曲線,然後才能進樣分析,所以需要提♀供標準品,我公司也可以提供標準品代購服務。